Dirk Koscieza, Dissertation, Fachbereich Physik der Universität Hamburg, 2000 :
Die gewöhnliche Proteinkristallographie vermag das Raum- und Zeitmittel einer Proteinstruktur zu bestimmen, doch es ist für eine große Anzahl von Proteinen bekannt, daß wesentliche Aspekte ihrer Struktur-Funktionsbeziehung auf dynamischen Änderungen ihrer Konformation beruhen. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit ein experimenteller Aufbau für den Wiggler-Strahl BW6 DORIS entwickelt, um stroboskopische Laue-Beugungsexperimente mit Nanosekundenzeitauflösung zur strukturellen Untersuchung extrem schneller Reaktionen zu ermöglichen. Hierzu wurde ein neuartiges Choppersystem konstruiert, das auf einem rotierenden Spiegel basiert, der extrem kurze Öffnungszeitfenster erzeugt, die mit anderen Choppern für weiße Röntgenstrahlung bisher nicht erreicht wurden. Die Zeitfenster von 440 ns Dauer (5%-Breite) erlauben die Extraktion einzelner Synchrotronpulse im Einzel- und Zweipuls-Modus von DORIS, womit 6 Wochen Strahlzeit pro Jahr für zeitaufgelöste Experimente zu Verfügung stehen. Zur Stimulation photolytischer Reaktionen wurde ein Lasersystem aufgebaut, mit dem Pulse vom UV bis ins IR erzeugt werden können. Die Synchronisation zwischen Choppersystem, Laser- und Synchrotronpuls regelt eine Triggerlogik, wobei der Zeitabstand der Pulse mittels einer adäquaten Meßanordnung überwacht wird. Die Anregungsbedingungen zur Laserpulsphotolyse von CO-Myoglobin wurden abgeschätzt, und ein Test an Myoglobinkristallen verifizierte, daß diese den berechneten Energiedichten standhalten. Die Funktionalität des Gesamtsystems wurde anhand eines zeitaufgelösten Experiments an met-Myoglobin demonstriert, das weltweit das dritte Laue-Beugungsexperiment an einer Proteinstruktur mit ns-Zeitauflösung darstellt. Die Messungen von statischer und angeregter Struktur erzielten hohe Vollständigkeit bei einer Bragg-Auflösung von bis zu 1,65 und einem mittleren Fehler auf die Atompositionen von \approx 0,36 . Es wurden sowohl Elektronendichtekarten als auch die Differenzfourierdichte zwischen beiden Strukturen berechnet, die oberhalb eines Kontourniveaus von 4s fünf Differenzdichten in der Häm-Umgebung zeigt. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen, daß mittels des Choppersystems Laue-Daten hoher Qualität an DORIS aufgenommen werden können und für Anregungsexperimente an MbCO gute Chancen bestehen, etwaige Konformationsänderungen zu identifizieren, insbesondere da das Experiment an met-Myoglobin gezeigt hat, daß thermische Effekte der Photonenabsorption die Proteinstruktur nicht relevant beeinflussen.
Conventional protein crystallography enables the space- and time-average of a protein structure to be determined. For a large number of proteins it is known, that essential aspects of their structure-function-relationship are related to dynamical changes in their conformation on the nanosecond time-scale. This thesis describes an experimental setup, that has been developed to allow stroboscopic, ns-time-resolved Laue-diffraction experiments for the structural investigation of extremely fast reactions at the wiggler-beamline BW6 DORIS at HASYLAB DESY. The main component is a novel chopper-system based on a rotating mirror, which exploits the light-leverarm to a distant slit in order to create extremely short time-windows not previously achieved with choppers for white x-radiation before. The time-window allows single-bunch extraction in both single- and two-bunch mode of the storage-ring, making 6 weeks of beamtime a year available for time-resolved studies. Excitation of photolytic reactions is achieved by a dye-laser-system that has been set up, capable of creating pulses from the UV to IR. Synchronisation between chopper, laser- and synchrotron-pulse is ensured by a special trigger-logic, holding the time-interval between the pulses constant to +/- 0.8 ns in single- and +/- 2.4 ns in double-bunch mode; in all cases the achievable time-resolution is dominated by the width of the laser-pulse of 7 ns. The time-interval between laser- and x-ray pulse is adjustable to any desired length and can be monitored with a specifically developed measurement setup. The appropriate excitation-conditions for complete photolysis in a time-resolved experiment on photoactive CO-Myoglobin have been estimated and an energy density of 9.3 mJmm2 at 658 nm was found. A test at this energy density verified, that the MbCO-crystal could survive over 50000 laser-pulses without any damage. The functionality of the chopper-system was tested in a stroboscopic diffraction experiment on met-myoglobin, which represents the third Laue-experiment on a protein structure with ns-time-resolution worldwide. The measurements on the static and the excited structure were taken with 3500 single bunches per frame and yielded a completeness of 71%, despite the fact that only a 110° rotation range was accessible. Both datasets reached a Bragg-resolution of 1.65 with an average positional error of app 0.36. In addition electron density maps of good quality were calculated. The difference Fourier density between both structures contains five difference-peaks above a contour level of 4s within the vicinity of the heme. The structural significance of these densities remains to be established. The results of this work prove that it is possible to collect Laue-diffraction data with ns-time-resolution and high Bragg-resolution with the mirror-chopper-system at DORIS. Hence there will be a good chance of observing ultrafast changes after photodissociation of CO-myoglobin in future experiments, especially since the experiment on the photochemically inactive met-myoglobin verified, that thermal effects due to photon absorption do not affect the protein structure significantly.