Kurzfassung
Die Roentgenstrukturanalyse ist eine der erfolgversprechendsten Methoden zur
Aufklaerung der dreidimensionalen Struktur biologischer Makromolekuele.
Das groesste Problem ist dabei - die erfolgreiche Kristallisation vorausgesetzt
- die Bestimmung der zu den gemessenen Intensitäten der Bragg-Reflexe
gehörenden Phasen.
Die Anbindung eines Streuers hoher Elektronendichte an spezifische
Stellen in der Einheitszelle (Derivatisierung),
kann zu messbaren systematischen Aenderungen in der Intensitaet der Reflexe
fuehren.
Die Methode des isomorphen Ersatzes verwendet diese Intensitaets-Aenderungen
zur Berechnung der Phasen.
Die Derivatisation von Kristallen der grossen ribosomalen Untereinheit von
Haloarcula marismortui wird vorgestellt und im Detail untersucht.
Es wurden 26 Datensaetze von Nativ- und verschiedenen Derivat-Kristallen
mittels Synchrotronstrahlung bei Kryotemperatur gemessen.
Das Erkennen moeglicher Strahlenschaedigungseffekte, sowie deren Einfluss auf
die Nutzbarkeit von Daten wird beschrieben.
Simulierte Nativ- und Derivat-Daten wurden erstellt und als Hilfsmittel fuer
die aufgefuehrten kristallographischen Untersuchungen verwendet.
Aufgrund des hohen Grades an Isomorphie-Problemen dieser Kristalle,
wurde der erfolgreiche Versuch unternommen, diese in Gruppen zu unterteilen,
fuer welche die Bestimmung der Phasen separat erfolgen kann.
Die resultierende dreidimensionale Elektronendichteverteilung (bei 12 Angstroem
Bragg-Aufloesung) wurde mittels Loesungsabflachung modifiziert.
Sie zeigt in Ausschnitten Bereiche mit Merkmalen, welche mit denen der
grossen ribosomalen Untereinheit vergleichbar sind.
Die Dichteverteilung zeigt intensive Kontakte der ribosomalen Molekuele in
Richtung der a- und b-Achse der Einheitszelle und eine relativ schwache
Verbindung entlang der c-Achse, welche die laengste Achse darstellt (ca. 570
Angstroem).
Diese Erkenntnisse ermoeglichen die Erklaerung verschiedener
Kristalleigenschaften und Beobachtungen waehrend der Kristallisationsphase.
Parallel wurde die Phasenbestimmung nach der Methode des molekularen Ersatzes,
unter Verwendung eines rekonstruierten Elektronenmikroskopischen Modelles der
ribosomalen 50S-Untereinheit von Thermus thermophilus durchgeführt.
Das Ergebnis traegt zum Verstaendnis der, auf der Roentgenstrukturanalyse
basierenden, Elektronendichteverteilung bei.
X-ray structure analysis is the most powerfull method for the determination of the three dimensional structure of biological macromolecules. The extraction of phases of the bragg-reflections measured from crystals is the most severe problem in biological crystallography. A high degree of attachment of a dense scatterer to selected positions in the unit cell (derivatisation), may result in systematic measurable changes in the intensity of the reflections. The isomorphous replacement method exploits these changes for the the calculation of phases. The derivatisation procedures of the crystals from the large ribosomal subunit from Haloarcula marismortui are presented and examinated in detail. 26 data sets of native- and different derivative-crystals where measured by synchrotron radiation at cryo temperature. The identification of possible radiation-decay-effects as well as their influence on the usefullness of the data are described. To assist the crystallographic examinations, simulated native- and derivative-data sets were constructed. Owing the high degree of non-isomorphism, observed for these crystals, a special effort was made to divide the crystals into groups with similar properties. The resulting three dimensional electron density map (at 12 Angstroem bragg-resolution) has been treated using the solvent-flattening procedure. It shows density with features compatible to those of the large ribosomal subunit. This map exhibits intensive interactions in a part of the unit cell, and rather poor connection along the c-axis, which is the longest one (ca. 570 Angstroem). The various parameters influencing the crystallisation are explained by these findings. Phase determination by the molecular replacement method was carried out in parallel, using a reconstructed electron microscopy model of the ribosomal 50S-subunit of Thermus thermophilus. The result was found to be helpfull for the understanding of the electron density map based on x-ray-structure-analysis.