Alexander Kelch, Dissertation, Fachbereich Physik der Universität Hamburg, 2000 :
Kurzfassung
Ziel dieser Arbeit war es, die Anwendbarkeit der nahfeldoptischen Mikroskopie (NFOM) im Hinblick auf
Penetrationsstudien lichtabsorbierender oder fluoreszierender Substanzen in Haut und Haaren
aufzuzeigen. Für diesen Zweck wurde ein kommerzielles NFOM so weit umgerüstet, daß Messungen im
UV-Wellenlängenbereich durchgeführt werden konnten. Zusätzlich wurde das System für simultane
Messungen des Transmissions- und des Fluoreszenzsignals erweitert.
Es konnten UV-Absorber anhand ihrer Absorption bei 300nm oder 350nm mit dem NFOM auf Glasträgern
abgebildet und lokalisiert werden. Für die Penetrationsstudie an Haut wurde unbehandelte und
behandelte Haut chemisch fixiert, in Ethanol dehydriert und in Eponharz eingebettet. 200nm
Dünnschnitte der Hautproben wurden mit dem NFOM untersucht. UV-Absorber konnten in den Dünnschnitten
nicht eindeutig lokalisiert werden, da die Variationen im Transmissionssignal zu stark waren.
Die Ursache für diese Variationen liegt in dem Auftreten unterschiedlicher Einflüsse auf das optische
Bild, wie Schichtdickenänderungen, Streuung und Oberflächenprofil.
Mit Hilfe der Immunmarkierung von Hautdünnschnitten konnte die Verteilung des Cytokeratins10 in der
Epidermis der Haut mit dem NFOM im Fluoreszenzmodus gezeigt werden. Diese Art der Hautpräparation
erlaubt das Lokalisieren von Proteinen und Lipiden mit höherer lateraler Auflösung als die konfokale
Laser-Raster-Mikroskopie. Außerdem eröffnet sich hiermit grundsätzlich die Möglichkeit, penetrierende
Substanzen im Hautinneren hochauflösend zu lokalisieren, falls sich die zu untersuchende Substanz
durch Antikörper markieren läßt.
Das hohe Potential der NFOM konnte weiterhin an Dünnschnitten humaner Haare, welche zuvor mit einem
Fluoresceinderivat eingefärbt wurden, demonstriert werden. Die Ergebnisse zeigten die Verteilung des
Fluorophors mit einer lateralen Auflösung von ca. 130nm, welche die klassische Lichtmikroskopie nicht
erreichen kann. Die NFOM-Bilder wiesen dabei einen nahezu identischen Kontrast wie die konfokale
Laser-Raster-Mikroskopie auf. Topographische Einflüsse der Probe auf das Fluoreszenzsignal sind im
Fluoreszenzmodus offenbar unerheblich. Deshalb bietet die Nahfeldoptik eine Alternative zur
klassischen Lichtmikroskopie für Penetrationsstudien fluoreszenzmarkierter oder fluoreszierender
Substanzen.
Ein großer Vorteil der NFOM besteht darin, daß die Topographie, Transmission und Fluoreszenz an
einem Areal einer Probe gleichzeitig gemessen werden kann. Um diese vielfältigen Informationen zu
erlangen, bedarf es ansonsten mehrerer Mikroskopietechniken, wie Elektronenmikroskopie,
Rasterkraftmikroskopie oder konfokale Laser- Rastermikroskopie.
The aim of the present work was to demonstrate the capability and feasibility of scanning near-field optical microscopy (SNOM) to study the penetration of UV-light absorbing or fluorescent molecules into human skin and hair fibres. For this purpose a commercial SNOM was modified, in order to operate in the UV wavelength range in transmission mode. In addition, the system was expanded for a simultaneous detection of fluorescence and transmission signals. UV-absorbers were imaged and localized on glass slides due to their specific absorption at 300nm or 350nm. For the penetration study human skin was chemically fixed, dehydrated in ethanol, and embedded in epon resin. 200nm thin sections of treated and untreated skin were investigated by SNOM. In such thin sections UV-absorber molecules could not be unequivocally identified and localized because of strong variations in the transmission signal. The signal variations are caused by other effects such as thickness variations, scattering, and surface profile dendent influences in SNOM transmission mode. Immuno labeled thin sections of human skin against cytokeratin10 investgated by SNOM in fluorescence mode revealed distinct and very sharp images of the cytokeratin10 distribution in human epidermis. On the one side this allows to localize proteins and lipids more precisely than confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging and on the other side this technique offers an additional way to investigate penetrating molecules if antibodies exist to the substance of interest. The high potential of SNOM was also demonstrated on thin sections of fluorophor stained human hair fibres. The results showed the distribution of the dye inside the hair with a resolution of about 130nm. This resolution is higher than classical light microscopy can ever achieve. SNOM images in fluorescence mode showed identical contrast and signal variations as in CLSM and hence no topographical nor scattering effects seems to disturbe the fluorescence signal. Therefore, SNOM is an alternative to classical methods for a penetration study of fluorophors or fluorescent labeled substances. A great advantage of SNOM imaging is the possibility to image simultaneously topography, transmission, and fluorescence of the same sample area, whereas to generate these various informations from one specimen with other techniques different microscopes such as electronmicroscopes, atomic force microscopes, or confocal laser scanning microscopes are necessary.