Antibakterielle Peptide sind ein Baustein des Immunsystems. Diese Peptide können Bakterien abtöten, ohne dabei die Zellen des Organismus zu beschädigen. Die Selektivität ihrer Wirkung beruht auf den verschiedenen Lipidzusammensetzungen der Zellmembranen. Für experimentelle Zwecke werden tierische Membranen am häufigsten mit neutralen Lipiden (wie Phosphatidylcholin) und bakterielle Membranen mit negativen Lipiden (wie Phosphatidylglycerol) eingesetzt. Die Zellmembranen bestehen jedoch aus vielen verschiedenen Lipidtypen, wobei alle zur Lipid-Peptid Wechselwirkung beitragen.
In dieser Arbeit wurden die unterschiedlichen Wechselwirkungen von antibakteriellen Peptiden mit zwei neutralen Lipidgruppen, Phosphatidylcholinen (PC) und Phosphatidylethanolaminen (PE), untersucht. Diese beiden Lipidgruppen unterscheiden sich strukturell durch ihre Kopfgruppe. Bei PC sind drei Methylgruppen und bei PE drei Wasserstoffe an den Stickstoff gebunden. An PE wurden bisher nur wenige Experimente zur Lipid-Peptid Wechselwirkung durchgeführt. PE sind ein wichtiger Bestandteil von bakteriellen Zellmembranen. Im Gegenteil zu PC bilden sie nichtlamellare hexagonale Phasen. Weitere Experimente wurden mit Lipopolysacchariden (LPS) durchgeführt, die aus der Membran von Salmonella minnesota isoliert wurden. Lipopolysaccharide bilden die Aussenseite der äusseren Membran gramnegativer Bakterien.
Für diese Arbeit wurden zwei bereits gut charakterisierte Peptide ausgewählt, Alamethicin aus dem Pilz Trichoderma viridae und Melittin aus Bienengift. Beide wirken antibakteriell und hämolytisch. Im kristallinen Zustand liegen beide Substanzen in einer gebeugten α-Helix vor. Alamethicin bildet spannungsabhängige Kanäle in Lipidmembranen. Melittin erhöht die Permeabilität der Membranen und bildet nur in manchen Fällen Kanäle.
Die Struktur der Lipid-Peptid Membranen wurde mit Hilfe der Kleinwinkelstreuung im Temperaturbereich von 5 bis 85/celsius/ bestimmt. Das Peptid-Lipid Verhältnis wurde von 1/10 bis 1/10000 (für POPC - palmitoyloleoyl phosphatidylcholin und POPE - palmitoyloleoyl phosphatidylethanolamin) und von 1/2 bis 1/50 (für LPS) variiert. Die Experimente wurden am Messplatz A2 am Hasylab, Desy in Hamburg durchgeführt. Aus den Beugungsbildern wurden die vorliegenden Lipidphasen und Gitterparameter bestimmt und im Anschluss Phasendiagramme konstruiert.
Die Wechselwirkungen von Alamethicin und Melittin mit Lipiden sind gleichartig. Beide lagern an den Kopfgruppenbereich der Membran an, der Grenze zwischen dem polaren und apolaren Membranbereich, was der amphiphilen Struktur der Peptidhelices entspricht. Der Einbau der Peptide in die Membran verändert deren Struktur. Diese ist bestimmt durch die elastische Krümmungsenergie (curvature elastic energy) und die entgegenwirkende Packungsfrustration (packing frustration) der Moleküle. POPC bildet nur lamellare Phasen. Der Einbau der Peptide erhöht die elastische Spannung, jedoch nicht stark genug, um die lamellare Struktur aufzubrechen. Um die elastische Spannung zu verringern, nehmen die Membranen eine wellenförmige Deformation an. POPE bildet bei niedrigen Temperaturen lamellare Phasen, die sich durch Erwärmen in nichtlamellare hexagonale Phasen mit einer hohen Krümmung umwandeln. Das Einfügen der Peptide führt zur Bildung von zwei bikontinuierlichen kubischen Phasen, welche einen optimalen Ausgleich zwischen Krümmungsspannung und Packungsfrustration darstellen.
Normalerweise bilden die Lipidmembranen mit Melittin zwei verschiedene kubische Phasen, Pn3m und Im3m. Das Verhältnis ihrer Gitterparameter beträgt annähernd 1.279. Dieser Wert ergibt sich aus den zu Grunde liegenden Minimalflächen. Die kubischen Phasen traten während des lamellar-hexagonalen Phasenübergangs auf und blieben beim Abkühlen bis zum Einsetzen der Gelphase bestehen. Trotz verschiedener Peptidkonzentrationen weisen die kubischen Phasen sehr ähnliche Gitterparameter auf. Zwischen den koexistierenden kubischen, hexagonalen und lamellaren Phasen treten mehrere Epitaxien auf. Diese wurden ebenfalls bei Membranen mit Alamethicin beobachtet. Der Grund hierfür ist der Einschluss aller Phasen in demselben Liposom, dem sogenannten Zwiebelliposom (onion vesicle). Dieses enthält mehrere Schichten aus unterschiedlichen Phasen.
Lipidmembranen mit Alamethicin bilden dieselben kubischen Phasen, deren Gitterparameter jedoch von der Peptidkonzentration abhängig sind. Die kubischen Phasen bilden sich hier aus der lamellaren Phase. Die Temperatur des Phasenübergangs und der relative Anteil jeder Phase ist ebenfalls von der Peptidkonzentration abhängig.
Zudem wurden Lipopolysaccharide aus den bakteriellen Stämmen R595 und R60 und der Lipidanker Lipid A untersucht. LPS R60 und Lipid A bilden kubische Phasen und LPS R595 lamellare Phasen. Melittin hat die Bildung von verschiedenen lamellaren und einer hexagonalen Phase bewirkt. Weitere Untersuchungen sind nötig, um den Mechanismus der Wechselwirkung zu verstehen.
Antimicrobial peptides are part of the immune system of most living creatures. They are able to kill invading bacteria and at the same time, they do not attack the host cells. Such selectivity in the peptide action is usually explained by the difference in the lipid composition of the cell membranes. In studies on the mechanism of action of antimicrobial peptides, the bacterial membranes are usually represented by negatively charged lipids like phosphatidylglycerols while the mammalian membranes by zwitterionic lipids like phosphatidylcholines. However, cell membranes contain a wide variety of lipid species which certainly contribute to the lipid-peptide interaction.
This study aims to investigate the difference in the interaction of antimicrobial peptides with two classes of zwitterionic peptides, phosphatidylethanolamines (PE) and phosphatidylcholines (PC). The structural difference between them is in the headgroup, with PE having three hydrogens bound to the nitrogen while PC three methyl groups. Phosphatidylethanolamines have been used in very few lipid-peptide studies up to date. They are an important component of bacterial membranes and unlike PC, they form nonlamellar hexagonal phases. Further experiments were performed on model membranes prepared from specific bacterial lipids, lipopolysaccharides (LPS) isolated from Salmonella minnesota. Lipopolysaccharides form the outer layer of the asymmetric outer membrane of Gram negative bacteria.
Two widely studied peptides were chosen for this study, alamethicin isolated from the fungus Trichoderma viridae and melittin isolated from bee venom. Both exhibit antimicrobial and hemolytic activity and their crystal and membrane-associated structure is an α-helix with a bend around Pro14. Alamethicin forms voltage-dependent membrane channels. Melittin causes vesicle leaking and in some cases forms transmembrane channels.
The structure of the lipid-peptide aqueous dispersions was studied by small- and wide-angle X-ray diffraction during heating and cooling from 5 to 85/celsius. The lipids and peptides were mixed at lipid-to-peptide ratios 10-10000 (POPE and POPC) or 2-50 (LPS). All experiments were performed at synchrotron soft condensed matter beamline A2 in Hasylab at Desy in Hamburg, Germany. The phases were identified and the lattice parameters were calculated.
Alamethicin and melittin interact in similar ways with the lipids. Both insert between the lipid headgroups in the polar-apolar interface and consequently change the average headgroup to chains cross section ratio. Insertion in the polar-apolar interface is favoured by the amphipathic structure of both peptide helices. The structures induced in the lipid membranes by the insertion of the peptide are the outcome of the competition between the curvature elastic energy and packing frustration. Pure POPC forms only lamellar phases. The insertion of a peptide between the headgroups increases the curvature stress although not enough to break up the lamellar structure. To relieve the stress, bilayers become undulated and the mean bilayer spacing increases. POPE forms lamellar phases at low temperatures that upon heating tranform into a highly curved inverse hexagonal phase. Insertion of the peptide induced inverse bicontinuous cubic phases which are an ideal compromise between the curvature stress and the packing frustration.
Melittin usually induced a mixture of two cubic phases, Im3m and Pn3m, with a ratio of lattice parameters close to 1.279, related to the underlying minimal surfaces. They formed during the lamellar to hexagonal phase transition and persisted during cooling till the onset of the gel phase. The phases formed at different lipid-to-peptide ratios had very similar lattice parameters. Epitaxial relationships existed between coexisting cubic phases and hexagonal or lamellar phases due to confinement of all phases to an onion vesicle, a vesicle with several layers consisting of different lipid phases. Alamethicin induced the same cubic phases, although their formation and lattice parameters were dependent on the peptide concentration. The cubic phases formed during heating from the lamellar phase and their onset temperature decreased with increasing peptide concentration. At low alamethicin concentrations, both Im3m and Pn3m formed and coexisted with the hexagonal phase. As the concentration of the peptide increased, the amount of hexagonal phase and Im3m decreased, until only Pn3m remained. Same epitaxial relationships were observed as for POPE with melittin.
Lipopolysaccharides (LPS), strains R595 and R60 and their ``endotoxic principle'' lipid A, were studied. Longer sugar-chain LPS R60 and lipid A form cubic phases and LPS R595 lamellar phases at the employed water content around 95/%. Melittin induced several lamellar phases and a hexagonal phase in all LPS varieties. Further experiments are necessary to understand the mechanism of interaction of LPS and melittin.