Kurzfassung
Der Einsatz ionisierender Strahlung ist wesentlicher Bestandteil der kurativen Therapie solider Tumore. Die letale Wirkung auf Tumorzellen basiert insbesondere auf der Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen. Dabei ist die Schonung des umliegenden Normalgewebes eine der größten Herausforderungen der Strahlentherapie und häufig kommt es zu starken, teilweise irreversiblen Nebenwirkungen. Oft wird die Bestrahlung zudem noch mit einer Chemotherapie kombiniert, was die Toxizität der Behandlung weiter erhöht. Daher ist die Suche nach alternativen zielgerichteten Therapien das Thema aktueller Forschung in der Radioonkologie.
Plattenepithelkarzinome des Kopf- und Hals-Bereiches (Head and neck squamous cell carcinomas, HNSCC) sind eine genetisch komplexe, heterogene Gruppe bösartiger Erkrankungen und weltweit die siebthäufigste Krebsart. Neben jahrelangem starken Tabak- und Alkoholkonsum ist die Infektion mit Hochrisikostämmen des Humanen Papillomvirus (HPV) ein weiterer wichtiger onkogener Faktor. Die Strahlentherapie ist auch bei der Behandlung von HNSCC ein zentrales Element der multimodalen Therapie. Aufgrund der im Kopf-Hals-Bereich vorhanden Risikoorgane wie z. B. der Speicheldrüsen und Schluckmuskulatur, stellt die Bestrahlungsplanung jedoch eine besondere Herausforderung dar und Patient:innen mit Tumoren im Kopf-Hals-Bereich leiden häufig lebenslang unter den irreversiblen Nebenwirkungen der Bestrahlung. Bezüglich des Ansprechens auf die Strahlentherapie haben sich HPV-positive Tumore als besonders empfindlich erwiesen und diese Patient:innen besitzen eine dementsprechend gute Prognose. Die Mechanismen hinter der erhöhten Strahlenempfindlichkeit sind noch nicht vollständig geklärt, allerdings wurde für HPV-positive Tumore bereits auf zellulärer Ebene eine erhöhte Strahlenempfindlichkeit, basierend auf einem Defekt in der Doppelstrangbruchreparatur, nachgewiesen. Während das wichtigste Ziel für Patient:innen mit HPV-positiven HNSCC eine sichere Deintensivierung der Behandlung ist, besteht das Ziel für Patient:innen mit HPV-negativen Tumoren in einer Verbesserung des Überlebens. Vorarbeiten aus dem Labor für Strahlenbiologie zeigen zudem, dass sowohl die Inhibition der DNA-Reparatur als auch die Inhibition des G2-Zellzyklus-Kontrollpunktes HNSCC-Zelllinien radiosensibilisieren kann. Die Inhibition des Enzyms PARP durch Olaparib führt zu zusätzlichen Schäden in der S- und G2-Phase; die Inhibition der Kinase Wee1 durch Adavosertib zur Hemmung der Zellzyklus-Kontrollpunkte, was zu einem vorzeitigen Eintritt in die Mitose trotz bestehender Doppelstrangbrüche, sowie zur Induktion von massivem Replikationsstress führt.
Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Dissertation die kombinierte Inhibition von PARP und Wee1 an drei strahlenempfindlichen HPV-positiven (UD-SCC-2, UM-SCC-47, UPCI-SCC-154) und drei radioresistenten HPV-negativen (HSC4, SAS, UT-SCC-60A) Zelllinien untersucht, um die strahlentherapeutische Behandlung von Patient:innen mit HNSCC zu verbessern. Die Inhibition von Wee1 führte in den HPV-positiven Zellen zu einer effektiven Aufhebung des G2-Arrestes, in den HPV-negativen Linien war der Arrest sowie seine Inhibition nur schwach ausgeprägt. Die alleinige Inhibition von PARP sowie die Zugabe von Olaparib zu Adavosertib hatten wenig Einfluss auf den G2-Arrest. In den HPV-negativen Zellen wurde bei letzterem die Reduktion des Arrestes sogar vermindert. Eine Analyse des Replikationsstressmarkers γH2AX in der Durchflusszytometrie zeigte sowohl in HPV-positiven als auch in HPV-negativen Zelllinien einen starken Anstieg der γH2AX-Signalintensität in S- und G2-Phase-Zellen nach der Inhibition von Wee1 und PARP/Wee1. Bereits eine Einzelgabe der Inhibitoren radiosensibilisierte HPV-positive und HPV-negative Zelllinien im delayed-plating Koloniebildungstest, die wirksamste Radiosensibilisierung war allerdings bei dualer Inhibition erkennbar. Die Auszählung residueller strahleninduzierter 53BP1 Reparaturfoci, als Marker für Doppelstrangbrüche in der Immunfluoreszenz, konnte zeigen, dass die Inhibition von PARP/Wee1 in den HPV-negativen Zellen zu einer erhöhten Focizahl führte, wohingegen die Anzahl der Reparaturfoci in den HPV-positiven Zellen nicht anstieg. Allerdings zeigte sich hier eine Abnahme der Foci in der G2-Phase und eine Zunahme der Focizahl in der G1-Phase. Dies deutet darauf hin, dass die Zellen trotz nicht-reparierter Doppelstrangbrüche die Mitose durchschreiten, was mit einem besonderen Risiko letaler Chromosomenaberrationen und des mitotischen Zelltodes verbunden ist. Von besonderer Bedeutung für das Zellüberleben ist, dass sich in allen verwendeten HNSCC-Zelllinien die Anzahl der nur gering geschädigten Zellen, welche die größte Überlebenswahrscheinlichkeit besitzen, nach dualer Inhibition verringerte.
Im Rahmen dieser Dissertation wird dargestellt, dass die duale Inhibition von PARP und Wee1 ein hochwirksamer Ansatz zur Radiosensibilisierung von HNSCC-Zelllinien ist. Zwar zeigten sich im Detail Unterschiede zwischen HPV-positiven und HPV-negativen HNSCC-Zelllinien, dennoch sollte dieser Ansatz bezüglich seines therapeutischen Nutzens weitergehend untersucht werden. Eine Radiosensibilisierung von HNSCC könnte die Effektivität der Strahlentherapie bei gleichzeitiger Reduktion der strahleninduzierten Nebenwirkungen ermöglichen.
The use of ionizing radiation is an essential component of curative therapy for solid tumors. The lethal effect on tumor cells is based on the induction of DNA double-strand breaks. One of the greatest challenges of radiation therapy is the protection of the surrounding normal tissue, which frequently leads to severe, sometimes irreversible side effects. Moreover, radiation is often combined with chemotherapy, which further increases the toxicity of the treatment. Therefore, the search for alternative targeted therapies is the topic of current research in radiation oncology. Head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) are a genetically complex, heterogeneous group of malignancies and the seventh most common cancer worldwide. In addition to years of heavy tobacco and alcohol use, infection with high risk strains of the human papillomavirus (HPV) is another important oncogenic driver. Radiation therapy is also a key element of multimodality therapy in the treatment of HNSCC. However, due to the presence of organs at risk in the head and neck region, such as e.g. salivary glands and swallowing muscles, radiation treatment planning is particularly challenging and patients with tumors in the head and neck region often suffer lifelong irreversible side effects from radiation. In terms of response to radiotherapy, HPV-positive tumors have been shown to be particularly sensitive and these patients have a correspondingly good prognosis. The mechanisms behind the increased radiosensitivity are not yet fully understood. However, increased radiosensitivity has already been demonstrated for HPV-positive tumors on cellular level, based on a defect in double-strand break repair. While the most important goal for patients with HPV-positive HNSCC is to safely deintensify treatment, the goal for patients with HPV-negative tumors is to improve survival. Preliminary work from the Laboratory for Radiobiology also shows that both inhibition of DNA repair and inhibition of the G2- cell-cycle-checkpoint can radiosensitize HNSCC cell lines. Inhibition of the enzyme PARP by Olaparib leads to additional damage in S- and G2 phase; inhibition of the kinase Wee1 by Adavosertib to inhibition of cell-cycle-checkpoints, resulting in premature entry into mitosis despite existing double-strand breaks, as well as induction of massive replication stress. In this context, this thesis investigated the combined inhibition of PARP and Wee1 in three radiosensitive HPV-positive (UD-SCC-2, UM-SCC-47, UPCI-SCC-154) and three radioresistant HPV-negative (HSC4, SAS, UT-SCC-60A) cell lines to improve the radiotherapeutic treatment of patients with HNSCC. Inhibition of Wee1 effectively abrogated the G2-arrest in HPV-positive cells while the arrest as well as its inhibition was weak in HPV-negative lines. Inhibition of PARP alone as well as the addition of Olaparib to Adavosertib had little effect on G2-arrest. In the HPV-negative cells, the reduction in arrest was actually diminished in the latter. Flow cytometry analysis of the replication stress marker γH2AX showed a strong increase in γH2AX signal intensity in S- and G2-phase cells after inhibition of Wee1 and PARP/Wee1 in both HPV-positive and HPV-negative cell lines. Even single doses of the inhibitors radiosensitized HPV-positive and HPV-negative cell lines in the delayedplating colony formation assay, but the most effective radiosensitization was evident with dual inhibition. Enumeration of residual radiation-induced 53BP1 repair foci, as markers of double-strand breaks in immunofluorescence, demonstrated that inhibition of PARP/Wee1 in HPV-negative cells resulted in an increased foci number, whereas the number of repair foci did not increase in HPV-positive cells. However, these showed a decrease in foci number in G2-phase cells and an increase in G1-phase cells. This indicates that cells undergo mitosis despite unrepaired double-strand breaks, which is associated with a particular risk of lethal chromosomal aberrations and mitotic cell death. Of particular importance for cell survival is the number of only slightly damaged cells, which have the highest probability of survival. This number decreased in all HNSCC cell lines used after dual inhibition. This thesis presents that the dual inhibition of PARP and Wee1 is a highly effective approach for radiosensitization of HNSCC cell lines. Although differences between HPV-positive and HPV-negative cell lines were shown in detail, this approach should be further investigated regarding its therapeutic benefit. Radiosensitization of HNSCC could improve the effectiveness of radiotherapy while reducing radiation-induced side effects.